骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物修复兔关节软骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.08.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验已成功将骨髓间充质干细胞接种于磷酸钙骨水泥支架，并证实其具有良好的机械强度和生物相容性。

目的：观察新西兰大白兔骨髓间充质干细胞体外培养后与磷酸钙骨水泥复合修复关节软骨缺损的可行性。

方法：选取18只新西兰兔用电钻制成股骨滑车部5 mm的骨-软骨缺损模型，随机选择15只兔于骨缺损处左侧植入单纯磷酸钙骨水泥材料作为对照组，于右侧植入骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物作为实验组，另3只兔不植入任何材料作为空白组。分别于4，8，16周各时间点处死兔取材，进行 X 射线摄片、组织形态学观察及生物力学检测。

结果与结论：术后 4，8，16 周各组骨缺损均有不同程度的骨再生，实验组新骨形成的速度和数量均优于其他组，组织学观察到实验组的成骨细胞及骨小梁出现均早于其他组。术后16周实验组骨标本抗弯曲能力的最大负荷、最大应力和破坏能量均明显高于对照组(P < 0.05)。结果表明骨髓间充质干细胞复合磷酸钙骨水泥材料修复骨缺损可促进骨组织再生，恢复骨的刚度和强度，有望作为一种新型人工骨材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 软骨生物材料, 磷酸钙骨水泥, 骨髓间充质干细胞, 骨缺损, 生物力学, 骨再生

Abstract:

BACKGROUND: In previous experiments, bone marrow mesenchymal cells have been successfully seeded onto the calcium phosphate cement scaffold, which is confirmed to have good mechanical strength and biocompatibility.

OBJECTIVE: To observe the feasibility of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells combined with calcium phosphate cements embedded in articular cartilage defects.

METHODS: Eighteen New Zealand rabbits were used to create 5 mm bone-cartilage defects on both sides of the mandible, and then, 15 rabbits were randomly selected and implanted with simple calcium phosphate cements into the left bone defects as control group and with bone marrow mesenchymal stem cells combined with calcium phosphate cement into the right bone defects as experimental group. Another three rabbits were implanted with nothing as blank group. After transplantation 4, 8, 16 weeks, rabbits from each group were sacrificed. Clinical observation, X-ray imaging, histological observation were performed at different periods.

RESULTS AND CONCLUSION: After 4,8,16 weeks, bone tissue regeneration in the experimental group was better than the other two groups in the bone formation speed and quantity. The maturity of new bone tissue, scaffold degradation, bone maturation in the experimental group was better than that in the other two groups. After 16 weeks, the maximum load, maximum stress and damage energy of the bone specimens in the experimental group were significantly higher than those in the control group. These findings indicate that bone marrow mesenchymal stem cells combined with calcium phosphate cement can promote bone regeneration, restore bone stiffness and strength, which is expected to act as a new artificial bone material in repairing bone defects.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Calcium Phosphates

中图分类号:

R318

周常艳，周庆焕，边竟，陈克，陈文. 骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物修复兔关节软骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(8): 1195-1199.

Zhou Chang-yan, Zhou Qing-huan, Bian Jing, Chen Ke, Chen Wen. Bone marrow mesenchymal stem cells combined with calcium phosphate cement to repair articular cartilage defects in rabbits [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(8): 1195-1199.

图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析 18只新西兰兔标本均进入结果分析，在实验过程中，未发生动物意外死亡事件。

2.2 兔骨髓间充质干细胞的形态 采用全骨髓培养法分离出兔骨髓间充质干细胞，传代细胞形态同原代细胞，呈集落样螺旋状生长，经过多次传代后椭圆形形态的细胞可变为纺锤形、长梭形等形态，生长进入相对平台期，见图2。

2.3 X射线拍片观察结果 术后4周， X线射片可见空白组骨缺损区出现低密度影，对照组骨缺损区可见磷酸钙骨水泥材料阻射影，实验组骨缺损区也可见材料阻射影，但较对照组减轻。术后8周，各组骨缺损低密度阴影均减小，术后16周，空白组的骨缺损区可见轻微骨凹陷，对照组和实验组骨缺损区材料阻射影消失(图3)。

2.4 大体形态观察和功能评价 所有动物均在术后4 h左右苏醒，创口均愈合良好，未发生创口红肿、炎症、化脓及裂开现象。

术后4周，空白组骨组织凹陷裂隙较深，未有新骨组织生成，仅见软组织，对照组骨缺损区凹陷不明显，磷酸钙骨水泥两端有少量新骨形成，并可见纤维骨样组织形成，实验组骨缺损区凹陷不明显，植入物两端可见较多骨痂形成。

术后8周，空白组仍未有新骨组织生成，骨组织凹陷裂隙较深，对照组磷酸钙骨水泥两端形成的新骨较4周明显增多，实验组植入物两端可见骨痂，与骨端联系较紧密。

术后16周，空白组同前，无新生骨变化。对照组磷酸钙骨水泥部分被新骨代替，骨痂未完全包绕，塑性不完整，实验组植入物两端骨痂形成，完全包绕植入物，缺损区骨端皮质连续，塑性完整。

2.5 各组骨缺损区力学性能比较 骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合培养6 h后，电镜下可见磷酸钙骨水泥支架材料表面和内部有兔骨髓间充质干细胞紧密黏附于支架材料，但是支架的空间结构未发生明显改变。

术后第16周实验组骨标本抗弯曲能力的最大负荷、最大应力和破坏能量的数值均明显高于对照组，两组间差异有显著性意义(P < 0.05，表1)，实验组和对照组各项数值均明显高于空白组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 各组兔骨缺损修复标本骨密度比较 术后4，8，16周实验组兔缺损区骨标本密度大于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05，表2) ，实验组和对照组各项数值均明显高于空白组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.7 组织学观察结果 术后4周，空白组仅见软组织，未有新骨组织生成，对照组骨缺损处有少量软骨化骨，实验组两侧新骨继续生长，可见不同时期的软骨细胞及成骨细胞，骨缺损部位无软组织长入。

术后8周，空白组骨组织凹陷裂隙较深，可见少量新骨形成，有少许成骨细胞，对照组缺损处大部分由纤维组织填充，有少许的软骨细胞增生，散在的骨小梁、骨基质形成，实验组骨缺损部位被新生骨填充，可见成熟的骨小梁，软骨细胞更成熟，可见少量的成骨细胞、破骨细胞。

术后16周，空白组同前，无新生骨变化。对照组可见成熟的骨小梁，可见少量的成骨细胞、破骨细胞，实验组新生骨较前更致密和连续。

参考文献

[1] Zhao L, Burguera EF, Xu HH, et al. Fatigue and human umbilical cord stem cell seeding characteristics of calcium phosphate-chitosan-biodegradable fiber scaffolds. Biomaterials. 2010;31(5):840-847.
[2] Zhao L, Weir MD, Xu HH. Human umbilical cord stem cell encapsulation in calcium phosphate scaffolds for bone engineering. Biomaterials. 2010;31(14):3848-3857.
[3] Fayaz HC, Giannoudis PV, Vrahas MS, et al. The role of stem cells in fracture healing and nonunion. Int Orthop. 2011; 35(11):1587-1597.
[4] Janicki P, Boeuf S, Steck E, et al. Prediction of in vivo bone forming potency of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Eur Cell Mater. 2011;21: 488-507.
[5] Kagami H, Agata H, Tojo A. Bone marrow stromal cells (bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells) for bone tissue engineering: basic science to clinical translation. Int J Biochem Cell Biol. 2011;43(3):286-289.
[6] Sommeling CE, Heyneman A, Hoeksema H, et al. The use of platelet-rich plasma in plastic surgery: a systematic review. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2013;66(3):301-311.
[7] Namazi H. Enhancing bone healing during distraction osteogenesis with platelet-rich plasma: a novel molecular mechanism. Injury. 2012;43(7):1225-1226.
[8] Latalski M, Elbatrawy YA, Thabet AM, et al. Enhancing bone healing during distraction osteogenesis with platelet-rich plasma. Injury. 2011;42(8):821-824.
[9] Kanthan SR, Kavitha G, Addi S, et al. Platelet-rich plasma (PRP) enhances bone healing in non-united critical-sized defects: a preliminary study involving rabbit models. Injury. 2011;42(8):782-789.
[10] Gustavsson J, Ginebra MP, Engel E, et al. Ion reactivity of calcium-deficient hydroxyapatite in standard cell culture media. Acta Biomater. 2011;7(12):4242-4252.
[11] Weir MD, Xu HH. Culture human mesenchymal stem cells with calcium phosphate cement scaffolds for bone repair. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2010;93(1):93-105.
[12] Yuan J, Zhang WJ, Liu G, et al. Repair of canine mandibular bone defects with bone marrow stromal cells and coral. Tissue Eng Part A. 2010;16(4):1385-1394.
[13] Zhou H, Weir MD, Xu HH. Effect of cell seeding density on proliferation and osteodifferentiation of umbilical cord stem cells on calcium phosphate cement-fiber scaffold. Tissue Eng Part A. 2011;17(21-22):2603-2613.
[14] Chen W, Zhou H, Weir MD, et al. Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cell seeding on calcium phosphate cement-chitosan-RGD scaffold for bone repair. Tissue Eng Part A. 2013;19(7-8):915-927.
[15] Yasuda H, Yano K, Wakitani S, et al. Repair of critical long bone defects using frozen bone allografts coated with an rhBMP-2-retaining paste. J Orthop Sci. 2012;17(3):299-307.
[16] Ginebra MP, Espanol M, Montufar EB, et al. New processing approaches in calcium phosphate cements and their applications in regenerative medicine. Acta Biomater. 2010; 6(8):2863-2873.
[17] Xu HH, Zhao L, Weir MD. Stem cell-calcium phosphate constructs for bone engineering. J Dent Res. 2010; 89(12): 1482-1488.
[18] Zhao L, Weir MD, Xu HH. Human umbilical cord stem cell encapsulation in calcium phosphate scaffolds for bone engineering. Biomaterials. 2010;31(14):3848-3857.
[19] Zhao L, Weir MD, Xu HH. An injectable calcium phosphate- alginate hydrogel-umbilical cord mesenchymal stem cell paste for bone tissue engineering. Biomaterials. 2010; 31(25): 6502-6510.
[20] Habraken WJ, Liao HB, Zhang Z, et al. In vivo degradation of calcium phosphate cement incorporated into biodegradable microspheres. Acta Biomater. 2010;6(6):2200-2211.
[21] Zou D, Guo L, Lu J, et al. Engineering of bone using porous calcium phosphate cement and bone marrow stromal cells for maxillary sinus augmentation with simultaneous implant placement in goats. Tissue Eng Part A. 2012;18(13-14): 1464-1478.
[22] Bonewald LF. The amazing osteocyte. J Bone Miner Res. 2011;26(2):229-238.
[23] Sell SA, Wolfe PS, Ericksen JJ, et al. Incorporating platelet-rich plasma into electrospun scaffolds for tissue engineering applications. Tissue Eng Part A. 2011;17(21-22): 2723-2737.
[24] Riaz R, Ravindran C, Ramkumar, et al. Efficacy of platelet rich plasma in sinus lift augmentation. J Maxillofac Oral Surg. 2010; 9(3):225-230.
[25] Franco D, Franco T, Schettino AM, et al. Protocol for obtaining platelet-rich plasma (PRP), platelet-poor plasma (PPP), and thrombin for autologous use. Aesthetic Plast Surg. 2012;36(5): 1254-1259.
[26] Aberg J, Brisby H, Henriksson HB, et al. Premixed acidic calcium phosphate cement: characterization of strength and microstructure. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2010; 93(2):436-441.
[27] Giocondi JL, El-Dasher BS, Nancollas GH, et al. Molecular mechanisms of crystallization impacting calcium phosphate cements. Philos Trans A Math Phys Eng Sci. 2010;368(1917): 1937-1961.
[28] Pina S, Vieira SI, Torres PM, et al. In vitro performance assessment of new brushite-forming Zn- and ZnSr-substituted beta-TCP bone cements. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2010;94(2):414-420.
[29] Vazquez D, Takagi S, Frukhtbeyn S, et al. Effects of Addition of Mannitol Crystals on the Porosity and Dissolution Rates of a Calcium Phosphate Cement. J Res Natl Inst Stand Technol. 2010;115(4):225-232.
[30] Silva TS, Primo BT, Silva Júnior AN, et al. Use of calcium phosphate cement scaffolds for bone tissue engineering: in vitro study. Acta Cir Bras. 2011;26(1):7-11.
[31] van de Watering FC, van den Beucken JJ, Walboomers XF, et al. Calcium phosphate/poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) composite bone substitute materials: evaluation of temporal degradation and bone ingrowth in a rat critical-sized cranial defect. Clin Oral Implants Res. 2012;23(2):151-159.
[32] Lee GS, Park JH, Won JE, et al. Alginate combined calcium phosphate cements: mechanical properties and in vitro rat bone marrow stromal cell responses. J Mater Sci Mater Med. 2011;22(5):1257-1268.
[33] Lee GS, Park JH, Shin US, et al. Direct deposited porous scaffolds of calcium phosphate cement with alginate for drug delivery and bone tissue engineering. Acta Biomater. 2011; 7(8):3178-3186.
[34] Zhao L, Tang M, Weir MD, et al. Osteogenic media and rhBMP-2-induced differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells encapsulated in alginate microbeads and integrated in an injectable calcium phosphate-chitosan fibrous scaffold.Tissue Eng Part A. 2011;17(7-8):969-979.

引言

材料方法

设计：随机对照动物观察实验。

时间及地点：于2013年9月至2014年3月在湖北医药学院附属太和医院生物医学研究所完成。

材料：

实验动物：选取2月龄健康雄性新西兰兔18只，体质量1.8-2.2 kg，平均2.0 kg，由湖北医药学院附属太和医院生物医学研究所提供。实验过程中对动物处置符合相关动物伦理学标准。

实验方法：

兔骨髓间充质干细胞的分离培养：将18只新西兰兔编号并标记，用3%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉，选择兔髂嵴处为穿刺点，将20 mL注射器针头刺入髂骨骨髓腔，接上含1 mL肝素生理盐水(1 000 U/mL)的无菌5 mL注射器，抽取骨髓3.0-4.0 mL，充分混匀后1 000 r/min低速离心5 min，弃上清液将骨髓细胞悬液按5×10⁸ L^-1细胞浓度接种于25 cm²培养瓶, 添加含体积分数为10%胎牛血清培养基至5-8 mL，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱饱和湿度培养，24 h后半量换液，48 h后全量换液，以后两三天换液1次。倒置显微镜逐日观察细胞生长状态，当细胞融合达80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化原代细胞3 min，再将消化后细胞调整浓度至1×10⁸ L^-1按1∶2比例传代接种培养。

骨髓间充质干细胞复合磷酸钙骨水泥支架制备：传代接种培养细胞融合达80%-90%时，更换为成骨诱导培养基(含体积分数为10%胎牛血清，50 µmol/L维生素 C， 10^-⁷ mol/L 地塞米松，10 mmol/L β-甘油酸钠)，每孔3 mL，48 h后全量换液，取第2代经成骨诱导培养的兔骨髓间充质干细胞按1×10⁹ L^-1细胞浓度接种于5 mm×5 mm×10 mm大小的磷酸钙骨水泥，置于37 ℃，体积分数为 5% CO₂培养箱饱和湿度培养6 h后用于动物实验。

骨缺损模型的制备与分组修复：所有新西兰兔再次用戊巴比妥钠麻醉，取膝关节内侧纵行切口逐层分离显露髌骨，将髌骨向外牵拉显露股骨滑车部，用电钻制成股骨滑车部5 mm的骨-软骨缺损模型，并随机选择15只兔于骨缺损处左侧植入单纯磷酸钙骨水泥材料作为对照组，于右侧植入骨髓间充质干细胞与磷酸钙骨水泥复合物作为实验组，另3只兔不植入任何材料作为空白组。所有缺损处缝合关闭前均覆盖一张Biogide生物膜，麻醉清醒后分笼饲养，任其自由活动。实验分组流程见图1。

X射线观察：于治疗后4，8，16周对各组兔膝关节进行X射线检测。经水合氯醛耳缘静脉注射麻醉后采取俯卧和右侧卧位，拍摄膝关节正、侧位X射线片。由2位资深放射科医生盲法阅片并提出诊断意见。观察股骨滑车部骨缺损低密度阴影值变化以评估缺损区骨生成情况及材料降解的程度。

骨密度测量：X射线检查后处死实验动物，取骨缺损修复标本进行骨密度检测并行组织学观察。

生物力学检测：治疗后16周各组标本在万能实验材料机上行三点抗弯曲实验。

主要观察指标：①扫描电镜观察骨髓间充质干细胞接种于磷酸钙骨水泥后的生长情况。②各组动物骨痂生长情况和骨密度。③骨缺损修补标本生物力学性能。

统计学分析：采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理，数据用x(_)±s表示，多组之间比较用单因素方差分析，组间的两两比较用q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

骨组织工程细胞种植基质材料包含多种材料，且均存在一定的缺陷，其中磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性和可降解性使其成为重要的生物支架材料^[4-10]。骨髓间充质干细胞被认为是具有多向分化能力的成体干细胞，因其取材容易，对机体损失小，增殖能力强，能稳定表达成骨细胞表型和易继续成骨等特点使其成为组织工程种子细胞的重要来源^[11-18]。磷酸钙的生物材料更易支持干细胞的成骨分化，在修复的同时生物支架材料有序降解而形成新生的骨组织^[19-24]。

实验将磷酸钙骨水泥与骨髓间充质干细胞相结合，利用骨髓间充质干细胞释放的细胞因子促进细胞在材料周围不断成骨，同时加速材料的降解，进而完成新生骨替代材料的渐变过程。手术后所有动物创口均愈合良好，未发生任何急、慢性毒性反应，手术切口未见红肿、炎症、化脓及裂开现象。考虑是因骨髓间充质干细胞为自体骨髓提取，同种属间免疫排斥很小，植入动物体内未引起明显的排斥反应，加之无机材料磷酸钙骨水泥具有良好的生物相容性^[25-29]。X射线观察证实了支架材料具有重建大段骨缺损的功能。组织学可见磷酸钙骨水泥支架材料表面和内部有兔骨髓间充质干细胞紧密黏附于支架材料，虽然电镜下见支架的空间结构未发生明显改变，但复合支架标本抗弯曲能力的最大负荷、最大应力和破坏能量的数值则明显升高，进一步证明有机材料磷酸钙骨水泥降解后形成的孔洞有利于骨髓间充质干细胞长入材料，不仅对原始骨髓腔的形成可能有一定的促进作用，使得骨标本密度显著增加，还影响了重建骨组织力学性能。

实验结果表明，经组织学观察发现空白组仅见软组织，未有新骨组织生成，对照组骨缺损处有少量软骨化骨，实验组两侧新骨继续生长，可见不同时期的软骨细胞及成骨细胞，骨缺损部位无软组织长入。术后8周，空白组骨组织凹陷裂隙较深，可见少量新骨形成，有少许成骨细胞，对照组缺损处大部分由纤维组织填充，有少许的软骨细胞增生，散在的骨小梁、骨基质形成，实验组骨缺损部位被新生骨填充，可见成熟的骨小梁，软骨细胞更成熟，可见少量的成骨细胞、破骨细胞。术后16周，空白组同前，无新生骨变化。对照组可见成熟的骨小梁，可见少量的成骨细胞、破骨细胞，实验组新生骨较前更致密，连续。自术后4周起，骨髓间充质干细胞复合磷酸钙骨水泥在重建骨缺损中新骨形成数量和骨组织成熟程度均优于单纯磷酸钙骨水泥支架材料组和空白组，空白组16周无新生骨变化，作者认为即使不植骨，骨组织有自我修复的能力，但长段的骨组织缺损区因无骨架支持，骨缺损组织空腔坍塌，进而严重影响成骨过程^[30-34]。

研究表明，磷酸钙骨水泥/骨髓间充质干细胞复合修复关节软骨缺损能早期恢复骨的刚度和强度，并能协同加快磷酸钙骨水泥的降解，使其与骨组织形成后的生物力学相匹配，后期达生物力学固定。

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